3 MATERIAL E MÉTODO

Este trabalho foi realizado no Centro de Cirurgia Experimental do Instituto de Pesquisas Médicas (Ipem) do Hospital Universitário Evangélico de Curitiba (Huec), Instituto de Tecnologia do Paraná (Tecpar), Laboratório de Patologia Experimental da Puc-PR e Centro Paranaense de Oftalmologia (CPO) - Curitiba, onde coletaram-se dados para planimetria digital e histologia.
Os animais foram transportados do Ipem para o CPO, em gaiolas apropriadas, onde foi instalado o aparelho de laser de Erbium:YAG para a realização do procedimento cirúrgico, retornando ao local de origem após o término deste.
Foram aplicadas as Normas para Apresentação de Documentos Científicos da Universidade Federal do Paraná e Instituto Paranaense de Desenvolvimento Econômico e Social (2001), utilizada a Nomina Anatômica Veterinaria (1983) e os princípios éticos em experimentação animal preconizados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, instituição filiada ao Internacional Council for Laboratory Animal Science.
Este trabalho foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Sociedade Evangélica Beneficiente de Curitiba

3.1 AMOSTRA

Foram utilizados 35 ratos Wistar (Ratus Norvegicus albinus, Rodentia mammalia), machos, adultos, entre 110 e 130 dias de vida, com peso entre 250 e 300 gramas no início do experimento, sem doenças prévias, procedentes do biotério do Tecpar.
Os animais foram separados aleatoriamente em cinco ratos por gaiola. Estes foram identificados com tatuagem em suas caudas com tinta atóxica (azul de metileno) e as gaiolas com etiquetas em suas paredes externas.

3.2 PRÉ-OPERATÓRIO

Os animais foram mantidos no biotério do Ipem, em gaiolas específicas para este fim, em temperatura ambiente, com livre acesso à água potável e ração de origem industrial padronizada. Cumpriram ciclo normal dia e noite e jejum pré-operatório de 12 horas anterior ao procedimento.
Para a pesagem utilizou-se balança eletrônica, modelo V-1200 (ACCULAB). A pesagem foi efetuada em todos os animais vivos de todos os grupos.
Um dia antes do procedimento cirúrgico, após anestesia, cada animal foi posicionado em decúbito ventral para a realização da tricotomia com lâmina de aço inoxidável (Gilletteâ - Gillette do Brasil Ltda) de toda a região toraco-dorsal. Com carimbo confeccionado para este fim, foram marcadas duas figuras de 22 x 22 mm na região tricotomizada, respeitando-se a distância mínima de 15 mm entre elas.
Os parâmetros para demarcação das figuras foram: superiormente o ângulo inferior das escápulas, inferiormente às cristas ilíacas e centralizados medialmente sobre a coluna vertebral. Denominou-se estas figuras de controle (posição cefálica) e experimento (posição caudal).
As figuras anteriormente marcadas com carimbo foram tatuadas com tinta de natureza atóxica. Foram tatuadas também barras na cauda dos animais (I a IIIII) para identificação de cada animal dentro de seu grupo.

FIGURA 1 - FOTOGRAFIA DO ANIMAL TATUADO

NOTA: Figura controle (C) em posição cefálica e figura experimento (E) em posição caudal e a identificação com linhas transversais na cauda (II).
Para a obtenção da contração tecidual foi estipulado que o plano vertical seguiria uma linha imaginária paralela à coluna vertebral (crânio-caudal) e o plano horizontal perpendicular à oluna vertebral (latero-lateral) (Figura 2).

FIGURA 2 - ANIMAL APÓS TRICOTOMIA COM O PLANO VERTICAL E HORIZONTAL

Os animais (n=35) foram divididos em 7 grupos (G1 a G7), com cinco animais cada. Os ratos dos grupos G1 (1 aplicação) , G2 (2 aplicações) e G3 (3 aplicações) receberam aplicações sucessivas de laser, os quais foram submetidos a ressecção de peça cirúrgica para estudo morfométrico e histológico.
O estudo da contração foi realizado nos animais dos grupos G3 a G7 (n=25), os quais foram submetidos às 3 aplicações sucessivas do laser e por aposição de folha de transparência, entre cada aplicação do laser, obteve-se cópia das figuras experimento e figuras controle.

3.3 ANESTESIA

Os animais foram anestesiados com éter sulfúrico, via inalatória, com ventilação espontânea (Figura 1). As vias aéreas foram mantidas pérvias para se evitar morte por asfixia. O nível anestésico foi controlado por observação direta do padrão respiratório e da imobilidade do animal. Cada animal foi colocado sob uma campânula de vidro, que continha algodão embebido em éter sulfúrico, na qual permaneceu em sistema fechado pelo tempo médio de cinco minutos, até a obtenção de plano anestésico. Considerou-se o animal anestesiado quando este se apresentava imóvel ao manuseio e manteve-se a anestesia com mascara em sistema semi-fechado durante os procedimentos.

Figura 3 - ANESTESIA DO ANIMAL.

3.4 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO

Tomou-se o cuidado de utilizar salas separadas para o procedimento anestésico e a aplicação do laser. Na sala destinada à utilização do laser foram respeitadas as normas de segurança quanto a sua utilização (óculos de proteção) e prevenção de explosões, não se utilizando comburentes (gás oxigênio) ou combustíveis (substâncias voláteis, como álcool ou éter) no mesmo ambiente.
O aparelho de laser Erbium-YAG (ESC Medical Systems Ltd., (Yokneam Industrial Park, Israel) ( Figura 4), foi programado nos seguintes parâmetros: Energia - 1,5 J e potência de 1,7 W, fluência de 21,4 J/cm2, tamanho do ponto do laser de 3mm sendo utilizado um gerador de padrões computadorizados (CPG), com regulagens: formato quadrado, tamanho 10, freqüência de repetição de 20 pps (pulsos por segundo), ângulo 0 e sobreposição de 30% (figuras 5).

FIGURA 4 - APARELHO DE ERBIUM: YAG

FIGURA 5 - PARÂMETROS UTILIZADOS NO ESTUDO

 

As figuras experimentos receberam três aplicações sucessivas de laser, não recebendo qualquer método hemostático ou limpeza entre cada passada. Foram coletados dados para a planimetria digital através de cópia das figuras controle e experimento por aposição de transparências.
Após cada aplicação de laser obteve-se amostras de tecido para o estudo histológico e morfométrico comparativo de cada aplicação. Tomou-se o cuidado de não ultrapassar cinco minutos das aplicações do laser, para evitar a ocorrência de edema que prejudicasse a morfometria.
Foram demarcados os fragmentos de tecidos a serem excisados para estudo morfométrico, contendo a figura experimento e a figura controle. Usando pinça anatômica e bisturi de lâmina número 20, foram ressecadas fragmentos retângulares